Relaciones filogenéticas de Rhodolirium montanum Phil. y especies afines, basadas en secuencias nucleotídicas de la región ITS y análisis cariotípico/Phylogenetic relationships of Rhodolirium montanum Phil. and related species based on nucleotide sequences from ITS region and karyotype analysis

RESUMEN. La taxonomía de los géneros chilenos de Amaryllidaceae es confusa, persistiendo problemas taxonómicos tanto a nivel de géneros como de especies. Actualmente existe controversia acerca de la correcta clasifi cación de especies hasta ahora asignadas a Rhodophiala C.Presl. A través del estudio de aspectos morfológicos, recientemente se ha sugerido la rehabilitación del género Rhodolirium Phil., donde Rhodolirium montanum Phil. es considerada como especie tipo. Esta especie ha sido denominada Rhodophiala rhodolirion (Baker) Traub en las clasifi caciones tradicionales. Dado que los datos morfológicos han provisto información limitada y ambigua en la clasifi cación de las Amarilidáceas chilenas, este trabajo evalúa la pertinencia de formalizar la rehabilitación del género Rhodolirium y en particular de la especie Rhodolirium montanum, a través de un análisis de morfología cromosómica y de secuencias nucleotídicas de la región ITS de seis especies nativas de Amaryllidaceae. Los datos moleculares indican que las especies Rhodophiala bagnoldii, R. montana, R. splendens, R. phycelloides y R. ananuca forman un grupo monofi lético más emparentado con Hippeastrum Herb. que con Rhodolirium, género que se presenta como grupo hermano de Phycella en el análisis fi logenético. La separación de Rhodolirium con respecto de Rhodophiala está respaldada por diferencias en número y morfología cromosómica, presentando el primero un número cromosómico de 2n = 16 y un índice de asimetría intracromosómica (Isc) de 0,46; mientras que el segundo posee 2n = 18 e Isc de 0,59-0,62. De esta manera, los resultados de los estudios cromosómicos y moleculares, junto a diferencias en exomorfología, tales como forma del estigma, perigonio y paraperigonio, apoyan la validez del género Rhodolirium Phil. y por ende de la especie Rhodolirium montanum Phil. PALABRAS CLAVE: Rhodophiala, Rhodolirium montanum, Amaryllidaceae, ITS, cariotipo. ABSTRACT. The taxonomy of Chilean Amaryllidaceae is confusing. Taxonomic problems still persist at the level of genera and species. Currently there is controversy about the correct classifi cation of species so far assigned to Rhodophiala C.Presl. Through the study of morphological characters, recently has been suggested the rehabilitation of the genus Rhodolirium Phil., where the species Rhodolirium montanum Phil. is considered as type species. This species was named Rhodophiala rhodolirion (Baker) Traub in traditional classifi cations. Since morphological data have provided limited and ambiguous information in the classifi cation of Amaryllidaceae in Chile, this paper assesses the relevance of formalize the rehabilitation of genus Rhodolirium and particularly the resurrection of the species R. montanum, through an analysis of chromosomal morphology and nucleotide sequences of the ITS region of six native species of Amaryllidaceae. The molecular data indicate that the species Rhodophiala bagnoldii, R. montana, R. splendens, R. phycelloides and R. ananuca form a monophyletic group more closely related to Hippeastrum than Rhodolirium. This genus is presented as closely related to Phycella in the phylogenetic analysis using ITS sequences. This separation of Rhodolirium with respect Rhodophiala is supported by differences in chromosome number and morphology, presenting the fi rst, chromosome number of 2n = 16 and intrachromosomal asymmetry index (Isc) of 0.46, while the latter has 2n = 18 and Isc of 0.59 to 0.62. Thus, chromosomal and molecular results together differences in exomorphology already mentioned by other authors support the rehabilitation of the genus Rhodolirium Phil. and the resurrection of the species Rhodolirium montanum Phil. KEYWORDS: Rhodophiala, Rhodolirium montanum, Amaryllidaceae, ITS, karyotype.






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Publication: Gayana. Botanica
Author: Muñoz, Manuel
Date published: January 1, 2011

INTRODUCCIÓN

La familia Amaryllidaceae comprende aproximadamente 60 géneros y alrededor de 850 especies distribuidas principalmente en las zonas cálidas, cuyos centros de diversifi cación se encuentran en Sudamérica, Sudáfrica y la región mediterránea de Europa (Meerow & Snijman 1998, Meerow et al. 2000a, Strydom 2005). Esta familia de geófi tas bulbosas se destaca por sus numerosos géneros cultivados como ornamentales, entre los que se encuentran Amaryllis L., Crinum L., Galanthus L., Leucojum L., Lycoris Herb. y Narcissus L. (Simpson 2006). Los géneros Placea Miers y Phycella Lindl., endémicos de Chile y el género nativo Rhodophiala C.Presl, presentan vistosas fl ores, por lo que han llamado la atención de los investigadores en fl oricultura dado su potencial ornamental (Schiappacasse et al. 2002, Olate & Bridgen 2005). No obstante lo anterior, entre los problemas taxonómicos más controvertidos de la familia está la falta de consenso en las clasifi caciones tribales y en las delimitaciones genéricas (Meerow et al. 1999, 2000a, 2000b) debido principalmente a la compleja variación morfológica de géneros tales como Hippeastrum Herb., Phycella y Rhodophiala (Arroyo & Cutler 1984).

En Chile, la taxonomía de Amaryllidaceae no ha estado exenta de confusiones y aun persisten problemas taxonómicos tanto a nivel de géneros como de especies (Ravenna 2003). Ejemplo de lo anterior es que, por muchos años, las especies de Amaryllidaceae de corola vistosa e infundibuliforme y con estigma capitado o trífi dos fueron consideradas tanto dentro del género Hippeastrum como de Rhodophiala (Marticorena & Quezada 1985). Basándose principalmente en caracteres morfológicos, Ravenna (2003) propone una nueva clasifi cación para los géneros chilenos de la familia Amaryllidaceae, citando 11 géneros y alrededor de 35 especies. Sin embargo, la simple delimitación morfológica de los géneros de la familia es difícil de establecer por la compleja variabilidad de los caracteres utilizados hasta ahora (Baeza et al. 2009).

Baeza & Schrader (2004) y Baeza et al. (2006, 2007a, 2007b, 2009) indican la importancia de los estudios cariológicos para clarifi car la posición taxonómica de los géneros de Amaryllidaceae chilenos. Anteriormente, otros investigadores ya habían señalado la signifi cancia del número y forma de los cromosomas en la clasifi cación genérica de esta familia (Naranjo & Andrada 1975, Naranjo & Poggio 2000, Meerow et al. 2000a, Palma-Rojas 2000).

El género Rhodolirium descrito por Philippi (1858), por muchos años estuvo inmerso en géneros, tales como Hippeastrum y Rhodophiala. Naranjo & Poggio (2000) propusieron la rehabilitación del género Rhodolirium sobre la base del número y morfología de los cromosomas. Ravenna (2003) acepta este género utilizando el nombre Rhodolirion, no existiendo una explicación clara para este cambio de nombre. Sin embargo, éste es un nombre utilizado por Baker (1878) cuando denominó las especies descritas por Philippi como sinónimos de Hippeastrum. También, Baker renombró a R. andinum como Hippeastrum rhodolirion. Posteriormente, en 1888, el mismo autor empleó Rhodolirion como un subgénero de Hippeastrum, considerando erradamente R. andinum como el tipo.

Desde el punto de vista morfológico, Rhodolirium incluye plantas uni- a plurifl oras, de perigonio infundibuliforme y tubo alargado, el paraperigonio, si está presente, es formado por lacinias o escamas libres, y el estigma es capitado. Este género comprende a cinco especies, las cuales se distribuyen desde el norte de Chile, en zonas de vegetación de neblina costera, hasta la provincia de Osorno por el sur, y desde el cinturón costero hasta el lado oriental de los Andes, en Argentina, a alturas entre 150-2500 m s.n.m. (Ravenna 2003).

Bajo los nuevos paradigmas de la taxonomía integrativa (Dayrat 2005), los datos morfológicos deben ser sometidos al fi ltro de otras aproximaciones y tipos de datos diferentes, entre ellos, la información a nivel molecular. Una de las regiones del genoma cuya variación es una valiosa fuente de caracteres informativos para la inferencia fi logenética en Angiospermas, es la región del espaciador interno transcrito (ITS) del ADN ribosomal nuclear 18S-26S (Baldwin et al. 1995). Meerow et al. (2000b), utilizando datos provenientes del análisis de la región ITS del cistrón ribosomal nuclear 18S-5,8S-26S, distinguen a Rhodophiala de Hippeastrum y sostienen que Rhodophiala tendría un origen aparentemente polifi lético. Además, el género Phycella aparecía como el grupo hermano a éstos y otros géneros americanos.

Puesto que el estudio de la región ITS ha resultado resolutivo en la delimitación de grupos fi logenéticamente más consistentes dentro de los géneros americanos de la familia Amaryllidaceae, los objetivos del presente estudio son determinar las relaciones de parentesco de cinco especies chilenas del género Rhodophiala y una única especie del género Rhodolirium, con respecto a otras especies de géneros afi nes cuyas secuencias ITS ya han sido publicadas e integrar a esta hipótesis de relaciones la información citológica de las especies y las evidencias provenientes de la exomorfología.

MATERIAL Y MÉTODOS

MATERIAL VEGETAL

Rhodophiala bagnoldii (Herb.) Traub y R. phycelloides (Herb.) Hunz. fueron recolectadas en Huasco, costa de la Región de Atacama; R. ananuca (Phil.) Traub en Aguada de Tongoy, costa de la Región de Atacama; R. montana (Phil.) Traub en Laguna del Maule, en la cordillera de la Región del Maule, R. splendens (Rengifo) Traub en Vilches Alto, cordillera de la Región del Maule y Rhodolirium montanum en Los Queñes, cordillera de la Región del Maule. Los ejemplares herborizados de cada una de estas especies fueron depositados en el herbario de la Universidad de Talca con los números 3357, 2407, 3358, 2269, 3015 y 2679, respectivamente. Además, se mantienen en cultivo bulbos de las especies mencionadas bajo invernadero frío en la Estación Experimental de Panguilemo de la misma institución. El material fue identifi cado utilizando las claves de identifi cación propuestas por Traub & Moldenke (1949) y Traub (1956) y posteriormente comparado con las descripciones originales.

Los caracteres morfológicos utilizados para confeccionar la Tabla II se observaron en ejemplares frescos y especímenes herborizados, además de consultar la literatura respectiva, Muñoz y Moreira (2000) y Ravenna (2003).

ANÁLISIS CROMOSÓMICOS

Para las especies mencionadas de Rhodophiala, a excepción de R. phycelloides, se realizaron preparaciones citológicas a partir de ápices radicales según el protocolo descrito por Grant et al. (1984) y adaptado por Muñoz et al. (2006).

Se tomaron cinco placas metafásicas provenientes de 2 a 4 plantas para cada especie. Se contabilizó el número cromosómico somático y para cada cromosoma se midió la longitud del brazo largo (BL) y del brazo corto (BC). Los cromosomas se agruparon en pares de acuerdo a su similitud y se ordenaron de mayor a menor tamaño. Con estas mediciones se calculó el índice centromérico (BC/LT x 100), fórmula cariotípica básica (Levan et al. 1964) y el índice de asimetría cariotípica (A1, intracromosómica) según la fórmula propuesta por Romero Zarco (1986).

ANÁLISIS MOLECULARES

La extracción de ADN se realizó a partir de 0.1 g de hojas jóvenes que fueron maceradas en 500 µL de buffer de extracción CTAB 2% (Tris 100 mM pH 8, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB 2%) y 2 µL de mercaptoetanol. Se incubó durante 30 minutos a 60°C y luego se adicionó 500 µL de cloroformo:fenol:alcohol isoamílico (25:24:1) seguido de centrifugado (5 min a 10.000 rpm). Después de la adición de 200 µL de isopropanol frío (-18°C) al sobrenadante, se centrifugó nuevamente (10 min a 11.000 rpm), se lavó el precipitado con etanol frío 70% y se resuspendió en agua deionizada estéril.

La región ITS fue amplifi cada utilizando los partidores ITS1-Plant-F, (5-CGCGAGAAGTCCACTG-3)' e ITS C26A-R (5'GTTTCTTTTCCTCCGCT-3') (Varghese et al. 2003). La amplifi cación se llevó a cabo en un volumen total de 50 µL, consistente de 35,2 µL de agua deionizada estéril, 5µL de buffer 10X (Fermentas), 1,25 µL de dNTPs (2 mM; Invitrogen), 3 µL de MgCl2 (25 Mm; Fermentas), 1 µL de cada partidor (10 pmol/µL) y 0,1 µL de Taq polimerasa (5U/µL) (Fermentas). Las amplifi caciones se realizaron utilizando el siguiente perfi l térmico: denaturación inicial a 94 °C por 3 min., para luego realizar 39 ciclos de 94 °C por 30 seg., reasociación a 50 °C por 1 min. y extensión a 72 °C por 1 min. Se fi nalizó con una extensión fi nal a 72 °C por 5 min. Los productos fueron visualizados mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% mediante tinción con bromuro de etidio (0,5 µg/mL).

Todos los productos amplifi cados fueron purifi cados y secuenciados por ambos extremos (Macrogen Inc., Seul, Corea). El alineamiento de las secuencias se hizo con el programa MAFFT 5.0 (Katoh et al. 2005) bajo métodos de refi namiento iterativos, incorporando la información del alineamiento más seguro tanto local (L-INS-i y EINSi) como global (G-INS-i). Se usaron los parámetros por defecto involucrados en cada algoritmo. Las secuencias fueron depositadas en Genbank con los siguientes números de accesión para cada especie: Rhodophiala montana (Genbank, FN436271), R. splendens (FN436273), R. bagnoldii (FN436270), R. phycelloides (FN436272), R. ananuca (FN386450) y Rhodolirium montanum (FN436274).

ANÁLISIS FILOGENÉTICO

LOS ANÁLISIS DE MÁXIMA VEROSIM ILITUD (ML) SE REALIZARON CON GARLI 0.951 (ZWICKL 2006). LA ELECCIÓN DEL M ODELO DE MEJOR AJUSTE FUE BASADO EN EL CRITERIO DE AKAIKE, AIC (POSADA & BUCKLEY 2004), USANDO EL PROGRAMA JMODELTEST (POSADA 2008). LOS ANÁLISIS FUERON fi NALIZADOS DESPUÉS DE 10000 SIN UN MEJORAM IENTO DE LA TOP OLOGÍA DEL ÁRBOL. PARA ASEGURAR CONVERGENCIA SE REALIZARON DOS ANÁLISIS DE ML. LOS SOPORTES DE CADA NODO FUERON EVALUADOS USANDO 200 ITERACIONES POR BOOTSTRAP (FELSENSTEIN 1985), CON CADA ITERACIÓN TERM INADA DESPUÉS DE 5000 GENERACIONES SIN un mejoramiento signifi cativo de la topología. Se realizó también un análisis Bayesiano usando MrBayes 3.0b4 (Ronquist & Huelsenbeck 2003). Al igual que en el análisis de ML, la elección del modelo basado en AIC se hizo con jModelTest (Posada 2008). Las cadenas de Markov Monte Carlo (MCMC) fueron corridas por 7 x 106 generaciones. Los árboles se muestrearon cada cien generaciones. La longitud de las ramas de los árboles fueron salvadas y el 25% del "burn-in" descartado después de grafi car el logaritmo de los valores de verosimilitud de los árboles muestreados contra el número de generaciones.

En la construcción de los fi logramas se utilizó como grupo externo Amaryllis belladona L. y A. paradisicola Snijman, cuyas secuencias ITS se encuentran en la base de datos Genbank con números de acceso AF373084 y AF373073, respectivamente. Además, se agregaron las secuencias de Rhodophiala bifi da (Herb.) Traub (AF223477) R. chilensis (L'Hér.) Traub (AF223480), Phycella ignea (Lindl.) Lindl. (AF223505) y de Hippeastrum brasilianum (Traub & J.L.Doran) Dutilh (AF223479), H. macbridei (Vargas) Gerea & Brako (AF223509), H. mollevilquense (Cárdenas) Van Scheepen (AF223477), e H. parodii Hunz. & A.A.Cocucci (AF223508).

RESULTADOS

ANÁLISIS CROMOSÓMICOS, FÓRMULA CARIOTÍPICA E ÍNDICES DE ASIMETRÍA

De las seis especies en estudio, cinco mostraron número cromosómico somático de 2n=18; sólo Rhodolirium montanum difi ere de las demás y presenta 2n=16 (Fig. 1). Los índices de asimetría de los cariotipos tienden a acercarse a 0,6 en la mayoría de las especies, diferenciándose aquél de R. montanum, que es de 0,46. En cuatro especies, los dos pares de cromosomas más pequeños son metacéntricos, los de mayor tamaño son submetacéntricos y subtelocéntricos (Fig. 1 A, B, C), en R. montanum los 2 pares más pequeños son subtelocéntricos y metacéntricos, los de mayor tamaño son metacéntricos, submetacéntricos y subtelocéntricos (Fig. 1D y Tabla I).

ANÁLISIS DE SECUENCIAS DE LA REGIÓN ITS

El fi lograma de la Figura 2 representa las relaciones fi logenéticas entre las especies analizadas en este estudio. Es posible observar dos clados con buen soporte de bootstrap (BS=100) y de probabilidad a posteriori (PP=1.0). En el clado inferior se forman dos subclados con buenos soportes (BS=100 y PP= 1.0). Un subclado incluye a todas las especies del género Hippeastrum cuyo número cromosómico diploide es 22 y el otro subclado a las especies pertenecientes al género Rhodophiala con un 2n=18.

En el clado superior se ubican dos subclados con buen apoyo (BS=100 y PP=1.0), separándose el género Phycella de Rhodolirium. Rhodolirium montanum difi ere en 15,5% de sus bases con respecto a las especies de Rhodophiala (640 sitios alineados). Esto se ve respaldado por diferencias tanto en su cariología (2n=16) como en su morfología (Tabla II) con respecto al género Rhodophiala.

DISCUSIÓN

Los resultados en cuanto a número y morfología cromosómica (Fig. 1) y topología del árbol fi logenético (Fig. 2) son consistentes en las delimitaciones genéricas de Rhodolirium, Rhodophiala, Phycella e Hippeastrum.

Rhodophiala e Hippeastrum aparecen como grupos monofi léticos más emparentados entre sí que con respecto a los otros géneros analizados. Esto explicaría la inclusión de Rhodophiala en Hippeastrum en tratamientos taxonómicos clásicos (Baker 1878, Marticorena & Quezada 1985). Meerow et al. (2000b) separaron estos géneros utilizando datos de la región ITS, lo cual es corroborado en el presente trabajo con las nuevas especies analizadas. Además esta separación está sustentada por diferencias en el número cromosómico, que en Hippeastrum es 2n = 22 y en Rhodophiala 2n = 18.

El otro grupo fi logenéticamente emparentado lo constituyen Phycella y Rhodolirium, compartiendo igual número cromosómico (2n = 16), sin embargo los datos moleculares son robustos en separar ambas entidades (Fig 2). Además, las especies de Phycella se distinguen morfológicamente de Rhodolirium por su perigonio recto, tubular o estrechamente campanulado, caracteres diagnósticos del género (Ravenna 2003). Los análisis realizados en este trabajo confi rman la separación del género Rhodolirium de Rhodophiala. Además de las diferencias moleculares y en el número cromosómico diploide, existen marcadas variaciones en la morfología cromosómica entre ambos géneros. La diferencia más notable entre Rhodophiala y Rhodolirium radica en que, en este último, los 2 pares de cromosomas de mayor tamaño corresponden a cromosomas metacéntricos (Fig. 1), característica observada en R. montanum (este trabajo), Rhodolirium speciosum (Herb.) Ravenna y Rhodolirium andicola (Poepp.) Ravenna (Baeza et al. 2009). Esta característica no se encuentra en los cariotipos de las especies de Rhodophiala descritos en este estudio ni en los descritos por Naranjo & Poggio (2000) para R. bifi da, R. elwesii y R. araucana.

Otra diferencia importante entre Rhodolirium y Rhodophiala se aprecia en el índice de asimetría cromosómica. Los índices de asimetría intracromosómica de Rhodophiala montana, R. splendens, R. bagnoldii y R. ananuca bordean los 0,6, diferenciándose de Rhodolirium montanum, cuyo índice de asimetría es de 0,46 que refl eja una distinta morfología cromosómica. Romero Zarco (1986) indica que este índice es una buena forma de expresar la morfología cariotípica general en plantas. Naranjo & Poggio (2000) determinaron índices de asimetría intracromosómica (A1) de 0,55 a 0,66 para Rhodophiala bifi da, R. elwesii y R. araucana, diferenciándose claramente de R. montanum (= Rhodophiala rhodolirion) y Rhodolirium andicola (=Rhodophiala andicola) cuyos índices de asimetría fueron 0,36 y 0,23 respectivamente. Aunque el número cromosómico mayoritariamente reportado para Rhodophiala es de 2n = 18 (Palma-Rojas 2000, Baeza et al. 2006). Naranjo & Poggio (2000) encontraron especies con dos citotipos, tal como ocurría para R. bifi da (2n=16 y 2n=18), y especies poliploides como sucede con R. elwesii (n= 18, 36, 72). Estos citotipos no se encontraron en las especies estudiadas.

Con los datos obtenidos por este estudio se da soporte cromosómico y molecular para la separación de Rhodolirium de Rhodophiala, evidencia que apoya el tratamiento taxonómico basado principalmente en datos morfológicos propuesto por Ravenna (2003), para estos géneros y en donde la especie Rhodolirium montanum corresponde al tipo del género.

En especial la inferencia fi logenética realizada en base a datos moleculares de la región ITS respalda a Rhodolirium como género válido. Por otra parte, la separación en el fi lograma de los distintos géneros analizados en grupos altamente soportados, confi rma la utilidad de la información provista por la región ITS en las delimitaciones genéricas en Amaryllidaceae americanas, tal como anteriormente lo reportara Meerow et al. (2000b).

En síntesis, Rhodolirium es un género endémico de Chile y Argentina compuesto por la especie tipo del género R. montanum y las especies Rhodolirium andicola, R. chilense, R. fulgens, R. laetum y R. speciosum (Ravenna 2003). La principal diferencia morfológica entre los géneros Rhodolirium y Rhodophiala (género tratado como Myostemma Salisb. por Ravenna l.c.), es el grado de división del estigma, que en Rhodolirium es siempre capitado, en cambio en Rhodophiala es trífi do (Baeza et al. 2009), el tubo del perigonio alargado (Philippi 1858) y un paraperigonio formado por escamas conspicuas, en muchas de sus especies. Cariológicamente las especies estudiadas del género Rhodolirium (R. andicola, R. laetum, R. montanum y R. speciosum) (Naranjo & Poggio 2000; Palma-Rojas 2000, Baeza et al. 2009) presentan un número cromosómico 2n=16, número compartido por otros géneros endémicos de Chile de la familia Amaryllidaceae: Placea Miers, Phycella Lindl. y Traubia Moldenke (Flory 1968, Palma-Rojas 2000, Baeza & Schrader 2004, Baeza et al. 2007a, 2009b), aunque la fórmula haploide es muy distinta (Baeza et al. 2009a), como también su morfología (Tabla II).

Sin duda, futuros estudios que combinen la morfología del cariotipo, los datos moleculares (ITS u otros) y la variación de los rasgos morfológicos de los géneros de Amaryllidaceae presentes en Chile dilucidarán la compleja taxonomía a nivel genérico de este grupo de plantas chilenas con potencial ornamental.

La correcta denominación de las entidades es necesaria para mejorar nuestro conocimiento de la biodiversidad (Valdecasas et al. 2008). El inadecuado tratamiento taxonómico de estos taxones refl eja la falta de conocimiento de la biodiversidad de la familia Amarilidácea chilena, con el riesgo de que entidades diferentes y, probablemente, con potencialidades y atributos disímiles, permanezcan ocultas en taxones débilmente justifi cados.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece el fi nanciamiento aportado por el proyecto FIA No BIOT-01-A-071 y al Dr. Marcelo Baeza (Universidad de Concepción) por el apoyo bibliográfi co y comentarios.

BIBLIOGRAFÍA

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Recibido: 20.05.10

Aceptado: 18.10.10

Author affiliation:

MANUEL MUÑOZ1,2, RICARDO RIEGEL1, PETER SEEMANN1, PATRICIO PEÑAILILLO3, FLAVIA SCHIAPPACASSE4 & JOSÉ NÚÑEZ5

1Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.

2Escuela de Graduados, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.

3Instituto de Biología Vegetal y Biotecnología, Universidad de Talca, 2 Norte 685, Talca, Chile.

4Departamento de Horticultura, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad de Talca, 2 Norte 685, Talca, Chile.

5Instituto de Zoología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile.

manuelmun@gmail.com

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